手把手教您如何完成質(zhì)粒DNA提取實驗

實驗方法原理：堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA，而染色體DNA不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去。

實驗材料：大腸桿菌
試劑、試劑盒：Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 異丙醇 溶菌酶 酚:lv仿 無水乙醇 LB培養(yǎng)基
儀器、耗材：超凈工作臺 培養(yǎng)箱 搖床 恒溫水浴鍋 臺式離心機(jī) 取液器 低溫冰箱 冷凍真空干燥機(jī) 電泳儀 水平電泳槽 紫外觀測儀
實驗步驟：
一、材料與試劑準(zhǔn)備
1. 材料：大腸桿菌。

2. 儀器：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機(jī)，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀。

3. 試劑：

（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。

（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。

（4）3 M NaAc pH5.2，高壓滅菌，4℃保存。

（5）異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/lv仿，無水乙醇，70%乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑。

二、操作步驟

1. 細(xì)菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過夜。

2. 離心10 min，5 000 rpm， 4℃；棄上淸液。

3. 沉淀（菌體細(xì)胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

4. 重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。

5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

6. 加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。

7. 加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。

8. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。

9. 取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。

10. 加入40 ul，3 M NaAc。

11. 酚/lv仿，抽提，乙醇沉淀。

12. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。

13. 取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

14. 電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。

手把手教您如何完成質(zhì)粒DNA提取實驗